A quoi sert une chromatographie ?
Invention de la chromatographie
Le phénomène de capillarité
Principe de la chromatographie
Quelque définitions: le vocabulaire de la chromatographie
Comment réaliser une chromatographie ?
Préparation de la cuve de chromatographie
Préparation de la plaque de chromatographie
Elution
Rvélation
Le rapport frontal
Interprétation d’un chromatogramme
A quoi sert une chromatographie ?
La Chromatographie est une technique d’analyse qui permet de déterminer la composition d’un mélange par comparaison à des espèces chimiques de référence. Elle permet de confirmer ou d’infirmer la présence d’une ou plusieurs espèces chimiques dans une substance.
Remarque: il est aussi possible d’utiliser la Chromatographie pour simplement vérifier si une substance est un corps pur ou un mélange ou en tant que technique de séparation.
Invention de la chromatographie
La technique de chromatogaphie a été mise au point par le botaniste russe Mikhaïl TSWET en 1900 alors qu’il tente de séparer la chorophylle et les caroténoïdes (des pigments végétaux). Il donne une première démonstration de cette technique en 1901 et il invente le terme de “Chromatographie” en 1906. La première Chromatographie qu’il réalise ne se fait fait pas sur une plaque mais sur une colonne composée de carbonate de calcium, les substances colorées y sont entrainées par par un liquide (éluant) composé d’éthanol.
Le phénomène de capillarité
La Chromatographie exploite le phénomène de capilarité: en raison des interactions entre ses molécules et celle d’un support solide, un liquide a tendance à être absorbé, à monter (les molécules de liquide sont attirées par les parois solides). La capilarité se manifeste en formant un ménisque à la surface d’un liquide (surface incurvée) mais aussi lors de l’absorption d’un liquide par solide comportant des interstice. Par exemple lorsqu’un sucre est trempé dans du café, le liquide y “monte” en raison de ce phénomène.
Principe de la chromatographie
Pour réaliser une Chromatographie on laisse un liquide (l’éluant) être absorbé (grâce à la capillarité) par une plaque. Sur cette plaque on dépose un échantillon du mélange à analyser ainsi qu’un échantillon des espèces chimiques dont on souhaite vérifier la présence. Toutes les espèces chimiques déposées sont entraînées par le liquide mais à des vitesse différentes: des espèces qui se trouvent au même niveau à la fin de la Chromatographie sont donc les mêmes. Les espèces chimiques du mélange forment des tâches distinctes à des hauteurs différentes et on les identifie en repérant les échantillons formant des tâches à la même hauteur.
Quelque définitions: le vocabulaire de la chromatographie
Voici un petit lexique des termes propres à la Chromatographie
CCM: il s’agit de l’acronyme de Chromatographie sur Couche Mince. Une CCM se réalise toujours avec un support qui sert de plaque de Chromatographie (la couche mince) mais il existe d’autres types de Chromatographie qui ne sont pas des CCM (par exemple Chromatographie sur colonne ou en phase gazeuse).
Phase fixe ou phase stationnaire: il s’agit de la plaque utilisée comme support de la Chromatographie qui est censée absorber l’éluant et où l’on réalise les dépôts des échantillons à analyser.
Eluant ou phase mobile: il s’agit du liquide absorbé par la plaque de Chromatographie qui entrâine avec lui espèces chimiques déposées sur la plaque. Il est à choisir en fonction des mélanges à analyser et du type de plaque choisi. Il peut s’agir simplement d’eau, d’eau salée, d’alcool etc)
Elution: étape de la Chromatographie lors de laquelle l’éluant migre vers le haut la phase fixe.
Chromatogramme: il correspond à l’image obtenu en fin de Chromatographie sur la phase fixe, il est constitué de la ligne de dépôt et surtout de l’ensemble des taches que l’on peut distinguer soit directement soit par révélation.
Ligne de dépôt: ligne horizontale tracée, avant le début de la Chromatographie, sur la phase fixe afin de déposer au même niveau un échantillon de toutes les substances chimiques (échantillon à analyser et espèces chimiques de référence)
Comment réaliser une chromatographie ?
Le protocole à suivre et le matériel à utiliser pour une Chromatographie dépendent de l’objectif (analyse rapide ou approfondie, séparation…) mais le cas d’une Chromatographie sur couche mince classique réalisée en classe de seconde voici la méthode en générale adoptée.
Les principales étapes de la réalisation d’une CCM sont les suivantes
– Préparation de la cuve de Chromatographie
– Préparation de la plaque de Chromatographie
– Elution
– Révélation (lorsque les espèces chimiques analysées sont incolores)
– Interprétation du Chromatogramme avec éventuellement détermination des rapports frontaux
Préparation de la cuve de chromatographie
La cuve utilisée pour une Chromatographie est un récipient en verre pouvant être fermé où la plaque de Chromatographie peut être suspendue ou déposée. L’éluant y est versé à raison d’une hauteur d’environ un demi centimètre (évitez les récipients à fond bombé pour lesquels la hauteur d’éluant n’est pas constante).
L’éluant à utiliser est en général indiqué par le protocole (cela dépend de la phase fixe et des espèces chimiques analysées), il peut s’agir d’un solvant pur (comme de l’eau ou de l’alcool) ou bien d’un mélange d’éluant.
Préparation de la plaque de chromatographie
La plaque est en général constituée d’aluminium (ou de plastique) recouvert d’un gel de silice permettant d’absorber (si on veut être rigoureur on parle d’adsorption) l’éluant mais il en existe d’autres modèles (en particulier lorsqu’on se limite à une analyse qualitative d’un mélange d’espèces colorées on peut se contenter d’un simple papier filtre voire de papier essuie-tout).
La première opération à réaliser est le tracée de la ligne de dépot. Pour cela la plaque doit être pris dans le sens “portrait”, du coté de du gel de silice (on non celui du plastique et de l’aluminium!).
La ligne est à tracer horizontalement à environ 1 cm du bord inférieur de la plaque au crayon à papier (l’utilisation de tout encre, de stylo bille, de stylo plume ou de feutre est à proscrire puisqu’elle serait susceptible d’être entraînée par l’éluant et de perturber la Chromatographie)
Lorsque la ligne de dépôt est tracée, on y dépose la substance à analyser ainsi que les espèces chimiques de références (auxquelles est comparée la substance à analyser).
Les dépots sont espacés au maximum les uns des autres sur la ligne de dépôts en evitant qu’ils soient trop proches des bords de la plaques. Ils se font de préférence à l’aide d’un capillaire (qui permet de mieux maîtriser la quantité déposée) mais faite de mieux on peut utiliser un cure-dent.
Lors de cette étape attention à ne peut endommager la plaque en la tordant ou en traçant la ligne de dépôt (ne pas trop appuyer avec le crayons). Faire aussi attention à ne pas “polluer la plaque avec d’autres substances (saisir la plaque par l’extrémité supérieure).
Elution
L’élution est l’étape lors de laquelle l’éluant migre vers le haut de la plaque de Chromatographie en entrainant les espèces chimiques initialement présentes sur la ligne de dépôt.
La plaque est déposée dans la cuve de Chromatographie (ensuite fermée) en veillant à ce que le bord inférieur de la plaque trempe dans l’éluant mais sans que le ligne de dépôt soit immergée.
La plaque doit être stable (appuyée sur une paroi de la cuve ou suspendue) et la cuve ne doit surtout pas être déplacée pendant l’élution.
Lors de cette étape chaque espèce chimique est entraînée par l’éluant à une vitesse qui lui est propre, l’écart se creuse entre ces espèces au fur et à mesure que l’éluant progresse.
La migration peut être longue, on la laisse en général progresser jusqu’à ce que l’éluant soit à environ un demi centimètre du bord supérieur. La plaque est alors retirée de la cuve, la limite supérieure atteinte par le l’éluant constitue le “front de l’éluant et ce dernier est marqué au crayon à papier avant l’éluant qu’il ne sèche.
Révélation (lorsque les espèces chimiques analysées sont incolores)
Lorsqu’une Chromatographie est réalisée sur des espèces chimiques incolores l’étape de révélation permet de les rendre visibles sur un Chromatogramme. Il existe des techniques chimiques adaptées à certaines espèces mais on utilise le plus souvent une technique physique reposant sur une exposition à un rayonnement ultraviolet (UV). Les plaques de Chromatographie combinent en général à la silice des pigments fluorescents à la lumière ultraviolette, etant donné que la majorité des composés organiques présentent une absorption aux UV proches du visible les zones où elles se situent apparaissent sous forme de taches sombres sur le Chromatogramme.
La plaque de Chromatographie est placée sous la lampe à ultraviolets (on utilise des lunnettes pour se protéger des UV) puis les tâches sombres sont repérées, on les entoure au crayon à papier pour pouvoir interpréter sereinement le Chromatogramme ensuite.
Rapport frontal
Le rapport frontal est une grandeur qui permet de caractériser une espèce chimique donnée lors d’une Chromatographie réalisée avec un solvant donné et une phase fixe donnée. Elle est assez peu utilisée et il n’existe que très peu de tables fournissant des listes de rapports frontaux car ils dépendent de facteurs trop nombreux (éluant, phase fixe, température…).
Le rapport frontal peut néanmoins être exploité lors de Chromatographie répétées dans des conditiosn identique.
Le rapport frontal est noté Rf, correspondant au rapport de la distance “h”par la distance “H”:
Rf = h / H
où:
– h est la distance parcourue par une espèce chimique déposée de la ligne de dépot jusqu’à sa position finale sur le Chromatogramme. (plus précisément entre la ligne de dépot et le centre de la tache)
– H est distance séparant la ligne de dépot du front de l’éluant.
– h et H sont exprimées toutes les deux dans la même unité (en général toutes les deux en centimètre ou toutes les deux en millimètre)
Remarques
– puisqu’il s’agit du rapport de deux longeurs, le rapport frontal est sans unité.
– puisque “h” est toujours inférieur à “H”, le rapport frontal est toujours inférieur à “1”
Interprétation du chromatogramme
Lors d’une Chromatographie des espèces chimiques migrent à la même vitesse et apparaisent à la même hauteur sur le chrommatogramme ce qui permet de tirer plusieurs informations d’un Chromatogramme:
– Si la substance anlysée présente une seule tache alors il s’agit d’un corps pur (constitué d’une seule espèce chimique)
– Si la substance anlysée présente plusieurs taches alors il s’agit d’un mélange (constitué de plusieurs espèces chimiques)
– si une substance analysée présente une tache au même niveau qu’une espèce chimique de référence alors on peut conclure à la présence de cette espèce dans la substance analysée.
– Le calcul du rapport frontal permet de déterminer la nature d’une espèce chimique inconnue.